光绪帝在位三十四年，然而在这三十四年里几乎都被慈禧太后控制着，虽然亲政后可以进行一些朝政的处理，但他并没有实际的决策权。这对于希望励精图治拯救国家于危难的光绪帝来说是痛苦的，唯一一次几乎是豁出去的戊戌变法最后还是被慈禧太后扼杀在摇篮中，光绪帝自己也被囚禁在瀛台。所以说慈禧和光绪之间的矛盾在晚年是急剧上升的。更为巧合的是当时中国最为重要的两个人物在1908年的一天几乎同时死去，这是轰动一时的，这也让世人们对光绪帝的死因充满了各种猜想。
曾在宫中担任女官的德龄女士在《清宫二年记》、《瀛台泣血记》等书中，说是李莲英下毒害死了光绪。鉴于德龄走的是畅销书的模式，其作品往往拿清宫秘事哗众取宠，似不可信。况且，光绪从小就受李莲英看护，一直叫他“谙达”(师傅)，并曾夸他“忠心事主”。光绪被囚瀛台后，其它太监慑于慈禧太后的淫威，不敢对光绪多有接近，唯有李莲英多方照顾，还经常到瀛台与光绪帝拆装钟表消遣。再有一事可以佐证，八国联军撤出北京后，慈禧一行人在回京途中，曾在保定驻跸。李莲英侍候慈禧太后睡下后，随后去光绪住处探望，只见光绪在灯前孤坐，无一太监值班。当时正是值隆冬季节，天寒地冻，光绪的房间竟然没有铺盖而无法入睡。李莲英见后抱着光绪的腿痛哭道：“奴才们罪该万死！”然后赶紧把自己的被褥抱过来给光绪。光绪后来回忆西逃的苦楚时也曾说：“若无李谙达，我活不到今天。”由此看来，说李莲英害死光绪似不可信。
溥仪在《我的前半生》一书中则谈到，袁世凯在戊戌变法时辜负了光绪的信任，在关键时刻出卖了皇上。袁世凯担心一旦慈禧死去，光绪帝决不会轻饶了他，所以就借进药的机会，暗中下毒，将光绪帝毒死。这种说法虽貌似事出有因，但以袁世凯当时的势力，毕竟还是难以接近宫廷，因而基本没有可信度。
《花随人圣庵摭忆》里也为光绪喊冤，说光绪并非善终，但其怀疑的对象却指向了隆裕皇后和其宠信的太监小德张，而幕后的指使人可能暗指慈禧太后。隆裕皇后是慈禧的侄女，她和光绪的婚姻简直就是一场灾难。作为当时后宫中的主要人物，隆裕皇后要搞点阴谋当然不是没有可能，但要说隆裕皇后能像她的那个姑妈那样心狠手辣，也不可信。
光绪的体质本来就不强壮，容易神经过敏，加以早年房事过度，腰病之生，由来已久。其身体禁不住刺激，神经稍受震动，或听到锣鼓响声，或受衣裤磨擦，或偶有性的刺激即行遗精，还不能经常吃补药，越吃遗精就越频繁。由此看来，光绪的病情是综合征，兼有肾炎、高血压、胃炎、肺痨等症，诸病齐发，极难救治。
光绪对中医并不信任，每次服中药前都要捧药详细检视。慈禧太后总跑去干涉内务府大臣关于皇帝的进食之事，光绪本听从太医的建议合理进食，这下又被气得不行，当场把枕头扔到地上以示抗议。光绪临终前的一段时间，虽在重病中，但仍旧要每天清早前往仪銮殿给慈禧太后请安，然后随同到勤政殿临朝，这种生活对于病魔缠身的光绪来说实在是一种莫大的折磨。虽然使用西医疗法后，光绪的腰痛减少，遗精也有所减少，但化验其尿样仍有少许蛋白质，估计其腰病还是一大隐患。
光绪正常治病有一个月后，某天光绪突然连呼腹疼，汗如雨下，捂着肚子在床上乱滚，连喊：“肚子痛的了不得！”当时正是非常之时，慈禧太后也病得快不行了，宫廷无主，乱如散沙。光绪这里无人管事，也没有御医，只有一位西医屈桂庭在床前。当时对光绪病状的判断是：夜不能睡，便结，心急跳，神衰，面黑，舌黄黑，但最奇怪的则频呼肚痛，这和前期的病症似乎没有什么关系。屈桂庭当时也觉得心里打鼓，感觉里面有问题，但也不敢多言惹祸上身。当时他能做的，就是让让光绪躺在床上，以毛巾施行热敷而已。等到光绪疼痛稍缓，屈桂庭便匆匆辞去。这也是屈桂庭进宫最后一次为光绪看病，此后宫内情形和光绪病状，屈桂庭自称毫无所知，只听说庆亲王奕劻被召入宫，酌商择嗣继位的问题，没过多久，便听说光绪已在瀛台涵元殿驾崩了。屈桂庭后来自己也说，光绪之死实是个难解之迷，以至斧声烛影，人言人殊，至于怎么回事，他也说不清楚。他说的这些东西，也只能为研究者提供佐证而已。
由国家清史编纂委员会主任戴逸教授等13位专家联合撰写的《清光绪帝死因研究工作报告》称，根据相关研究，常人口服砒霜60至200毫克就会中毒身亡。光绪帝摄入体内的砒霜总量明显大于致死量。其胃腹部衣物上的砷是其含毒尸体腐败后直接侵蚀遗留所致，而其衣领部位及头发上的大量砷，则由其腐败尸体溢流侵蚀所致。
中央电视台主任编辑钟里满则以光绪帝临终前参与诊治的医生亲笔回忆录及搜集到的军机大臣的日记等为依据，进一步确定了光绪帝属急性胃肠性砒霜中毒而亡这一结论。
至于究竟是谁将光绪置于死地，说法最多的有二种。一是背叛光绪帝的袁世凯担心慈禧死后遭到光绪的报复，在预谋废黜光绪帝失败后，收买宫人下毒将其杀害。另一种，也是被认为可能性比较大的说法。是慈禧太后为了不让自己庇护的利益受损，担心自己死后光绪帝大刀阔斧，便在自己死前先害死了光绪帝。但不论是谁想害光绪，光绪的身体其实也已经开始不行了，光绪的死已是迟早的事情。
